zeptometrix  0801008說明書 

HIV-1 p24 Antigen ELISA 2.0

預(yù)期用途
retro-tek hiv-1 p24抗原Elisa 2.0是一種用于檢測人類免疫缺陷的酶聯(lián)免疫分析方法。
細(xì)胞培養(yǎng)基中的病毒1型（HIV-1）p24抗原。它可用于監(jiān)測
HIV-1或測定基于HIV-1的慢病毒樣本的滴度。因?yàn)閜24的氨基酸序列在
不同的HIV-1分離株，本試驗(yàn)檢測了來自HIV-1亞型a-f的p24。對人類沒有交叉反應(yīng)。
免疫缺陷病毒2型（HIV-2）、猴免疫缺陷病毒（SIV）或人類T細(xì)胞白血病病毒I型和II型
（htlv i和ii）p24或任何gag基因產(chǎn)物。
retro-tek hiv-1 p24抗原Elisa 2.0僅供研究使用。不用于診斷程序。
試驗(yàn)原理
微孔板上覆蓋著一種單克隆抗體，該抗體對HIV-1的p24 gag基因產(chǎn)物具有特異性。HIV-1 p24抗原
在樣品培養(yǎng)期間，將樣品特別捕獲到固定抗體上。然后捕獲的抗原
與人抗HIV-1抗體結(jié)合辣根過氧化物酶（HRP）反應(yīng)。在隨后添加
底物，顏色隨著HRP酶的反應(yīng)而發(fā)展。合成的光密度與HIV-1 p24的量成正比。
樣本中存在抗原。然后繪制一組標(biāo)準(zhǔn)稀釋液的吸光度值。p24的量是
通過點(diǎn)到點(diǎn)圖的插值或標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸分析確定。
試劑
供應(yīng)材料：
•用于96次測定的HIV-1 p24抗體涂層微孔板，5個(gè)平板：12x8井條。涂有鼠藥的水井
抗HIV-1 p24的單克隆抗體。
•HIV-1 p24檢測抗體，5 x12 ml：含有HRP（辣根過氧化物酶）-與HIV-1結(jié)合的人抗體
從HIV-1人源材料中純化。
•HIV-1 p24抗原標(biāo)準(zhǔn)，5 x 0.5 ml：含有來自山羊HIV-1 IIIB的被破壞的、熱滅活的病毒抗原。
血清，Triton X-100®，疊氮化納。
•溶解緩沖液，5 x 5 ml:Triton X-100®在PBS和2-氯乙酰胺中。
測定稀釋劑，5×100毫升：含有山羊血清，PBS，Triton X-100®，和2-氯乙酰胺。
•10x洗板緩沖液，5 x 125 ml：含有PBS、Tween 20®和2-氯乙酰胺。
•基質(zhì)，5 x 12 ml：含有四甲基聯(lián)苯胺（TMB）。
•微孔板封閉劑（1 pk）：每包10個(gè)封閉劑
•停止溶液，5 x 12 ml：含有鹽酸（HCl）。
•封板劑：5 x10
•可再密封塑料袋：5個(gè)
？Triton X-100是Union Carbide Chemicals and Plastics Co.，Inc.的注冊商標(biāo)。Tween 20是
帝國化學(xué)工業(yè)的商標(biāo)。

存儲
將所有試劑盒儲存在2°-8°C的溫度下。不要冷凍。當(dāng)正確存放時(shí)，該套件在包裝盒上注明的日期前是穩(wěn)定的。
標(biāo)簽。
所需但未提供的材料：
•一次性手套
•經(jīng)驗(yàn)證的可調(diào)節(jié)微量移液管，單通道和多通道
•用于制備樣品和控制稀釋的試管和試管架
•量筒和各種燒杯
•經(jīng)驗(yàn)證的自動(dòng)微孔板清洗機(jī)或手動(dòng)真空抽吸設(shè)備
驗(yàn)證培養(yǎng)箱溫度為37°C±1°C
•經(jīng)驗(yàn)證的微孔板讀卡器
計(jì)時(shí)器
•1%次氯酸鈉作為消毒劑。可由家用漂白劑制成
•蒸餾水或去離子水
注意事項(xiàng)
僅供研究使用。不用于體外診斷。
•進(jìn)行分析前，仔細(xì)閱讀所有說明。
•使用通用預(yù)防措施處理套件組件和試樣。
•為避免交叉污染，對每個(gè)樣品使用單獨(dú)的吸管頭。
•當(dāng)測試潛在感染性人體樣本時(shí)，遵守所有適用的地方、州和聯(lián)邦法規(guī)。
關(guān)于生物有害物質(zhì)的處理。
•HIV-1 p24抗原標(biāo)準(zhǔn)含有疊氮鈉作為防腐劑。疊氮化納可能與鉛或銅管發(fā)生反應(yīng)。
形成爆炸性的金屬疊氮化物。處理后用大量水沖洗管道，以防止疊氮化物在
排水溝。
•停止溶液含有鹽酸，可能導(dǎo)致嚴(yán)重?zé)齻Ｈ绻佑|到眼睛或皮膚，請沖洗
立即用水并尋求醫(yī)療救助。穿防護(hù)服和護(hù)目鏡。
•用于制造HIV-1檢測儀抗體的人源材料已經(jīng)過測試，結(jié)果為陰性。
乙型肝炎表面抗原。用于制備HIV-1 p24抗原標(biāo)準(zhǔn)的病毒裂解液已被
化學(xué)破壞和加熱。把這些試劑當(dāng)作能傳播傳染源的試劑來處理。
•盡管p24抗原保存良好，但一些HIV-1分離株和重組克隆可能表現(xiàn)出輕微的反應(yīng)性。
與HIV-1 p24抗原標(biāo)準(zhǔn)相比的差異包括該試劑盒。

試劑的制備
•使用前將所有試劑置于室溫。
•洗板緩沖液：使用前，將10倍洗板緩沖液1:10在蒸餾水或去離子水中稀釋。1X洗板緩沖器
可在2°-8°C下儲存1周。10倍洗板緩沖液（目錄：0801060）的附加瓶可
命令。
•洗板：將洗板機(jī)或其他點(diǎn)膠設(shè)備的點(diǎn)膠量設(shè)置為至少350微升或高達(dá)
可能不會(huì)溢出微孔板。這將確保*洗井并防止?jié)撛诘?br />由移液管或板密封件拆卸過程中可能發(fā)生的試劑飛濺引起的信號背景。
•試驗(yàn)準(zhǔn)備：標(biāo)記用于制備標(biāo)準(zhǔn)和樣品的試管。在每條帶子的末端貼上標(biāo)簽
標(biāo)簽，以確定試紙條在分析過程中是否與板架分離。如果整個(gè)96孔板
不要使用，從板架上取下多余的條帶。將多余的條帶和干燥劑放入可重新密封的塑料中
包裝、密封并在2°-8°C下儲存。
•HIV-1 p24抗原標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)HIV-1 p24抗原標(biāo)準(zhǔn)制備一系列六個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。使用稀釋液
表1中的方案。在完成檢測后，任何稀釋的HIV-1 p24抗原標(biāo)準(zhǔn)都應(yīng)
丟棄的。

標(biāo)準(zhǔn)品不需要用溶解緩沖液處理。
•試樣：將50微升溶解緩沖液移液至450微升樣品中，在試管中處理樣品，并充分混合。
或者，只要樣品被1/10體積的溶解緩沖液破壞，就可以使用其他體積。未知的
樣品建議制備一套10倍稀釋液，以確保其中一種稀釋液符合標(biāo)準(zhǔn)。
曲線。可以用分析稀釋劑或細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋。處理過的樣品可以長期保存在
-20℃或更低（如有必要） 

試驗(yàn)程序
步驟1：用350μl 1X洗板緩沖液和
抽吸。預(yù)洗去除了微孔板穩(wěn)定劑，是實(shí)現(xiàn)均勻和宜反應(yīng)性的必要條件。
用倒置的微孔板或吸水毛巾墊上的條狀物*吸干。繼續(xù)罷工直到不行
液滴留在井里。添加樣品前，不要讓洗過的盤子*干燥。干燥
會(huì)對測試結(jié)果產(chǎn)生不利影響。
第二步：用準(zhǔn)備好的標(biāo)準(zhǔn)配置兩條帶，如下所示。在
化驗(yàn)。此井用于基板空白。用移液管將200微升的標(biāo)準(zhǔn)品1-6移到重復(fù)井和7（0 pg/ml）中。

第3步：用移液管將按照“試劑制備”一節(jié)所述制備的每個(gè)試樣200微升移到重復(fù)孔中。
第4步：用平板密封器覆蓋微孔板，并在37°C±1°C下培養(yǎng)至少1.5小時(shí)或過夜（多24小時(shí)）。
孵育時(shí)間短可能導(dǎo)致微板邊緣效應(yīng)。培養(yǎng)時(shí)間越長，敏感性越高。
步驟5：如步驟1所述，抽吸和清洗板6次。
步驟6：用移液管將100微升HIV-1 p24檢測抗體移入每個(gè)孔中，底物空白除外。用一個(gè)
在37°C±1°C下培養(yǎng)1小時(shí)。
步驟7：如步驟1所述，抽吸和清洗板6次。
第8步：用移液管將100微升基質(zhì)移入所有培養(yǎng)孔中，在室溫（18°-25°C）下培養(yǎng)30分鐘。一
在含有病毒抗原的井中會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色。
第九步：用100微升停止液移液管將反應(yīng)停止。將導(dǎo)致顏色從藍(lán)色變?yōu)辄S色。
第10步：在15分鐘內(nèi)，用一個(gè)微板閱讀器在450納米處讀取每個(gè)孔的光密度。

計(jì)算和解釋結(jié)果
測試有效性：
•0.0 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)的光密度不應(yīng)超過0.120。如果兩個(gè)或更多的井高于0.120，則測試
無效。
•125 pg/ml p24標(biāo)準(zhǔn)的光密度值應(yīng)大于1.100，否則試驗(yàn)無效。
•測試樣品的平均吸光度讀數(shù)必須低于125 pg/ml，否則必須重新測試樣品。
在更高的稀釋度范圍內(nèi)。如果試樣的平均吸光度讀數(shù)低于
3.9 pg/ml，則p24濃度低于分析定量限值。

截止值的確定：
在0.0 pg/ml樣品光學(xué)值的平均值上添加0.030的預(yù)定系數(shù)。這是對
檢測化驗(yàn)結(jié)果。該值是確定截止值的一般準(zhǔn)則。或者，更準(zhǔn)確的結(jié)果可能
通過在一組已知的負(fù)樣品的平均光密度中添加至少兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差來獲得。
樣本建立統(tǒng)計(jì)截止值。吸光度值大于或等于截止值但
低于3.9 pg/ml的平均吸光度值被認(rèn)為是定性陽性。

要量化HIV-1 p24的水平：
計(jì)算每個(gè)p24標(biāo)準(zhǔn)品和試樣的平均吸光度。使用線性圖紙或計(jì)算機(jī)繪圖
軟件，在X軸上繪制HIV-1 p24抗原標(biāo)準(zhǔn)（pg/ml）的濃度與
Y軸上的每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。然后用插值法或線性法測定標(biāo)本中HIV-1 p24抗原的濃度。
從標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行回歸分析。確保對所有稀釋進(jìn)行校正，包括在
添加溶解緩沖液。供試品吸光度值必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)才能準(zhǔn)確定量。
病毒滴度（tu/ml）的測定：
慢病毒的每個(gè)物理粒子（pp）大約有2000個(gè)p24分子：
（2×103）
）x（24 x 103 da，每pp p24），48 x 106
/阿伏加德羅=（48 x 106
）/（6 x 1023）=8 x 10-17g P24/聚丙烯，大約
每1 x 10-16g P24 1 pp，每p24 1 x 104 pp。
一個(gè)包裝合理的VSV-G假型慢病毒載體的感染指數(shù)為每1000個(gè)單位1個(gè)單位。
物理粒子（pp）至1 tu/100 pp（或更小）。因此，p24的范圍約為10至100 tu/pg。
精度數(shù)據(jù)

資料
西奧菲勒斯。vijaykumar，avindra Nath）和氯喹（Ashok Chauhan，”大學(xué)的星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的分子調(diào)節(jié)方法
增強(qiáng)permissiveness到HIV感染的病毒學(xué)，381號（11月10日，2008）：1～5。
切麗t ng et al.，“被動(dòng)控制viremia把刀neutralizing抗體和B細(xì)胞的反應(yīng)enhances macaques嬰兒。”
NAT，16，10號（2010年10月3）：1117～1119。
曼努埃爾一V。F。。。。。。。。。。。。。。gonçalves等人，“快速和敏感的慢病毒載體為基礎(chǔ)的多基因表達(dá)的檢測與監(jiān)控
和quantify細(xì)胞融合活動(dòng)，《PLoS One 5、6號（2010年6月3 e10954）。