可擴增RNA的產量更高

使用來自各種組織的FFPE樣品的RNAstorm™試劑盒可以看到RNA產量和質量的顯著改善（通過可擴增RNA的量來衡量），其年齡范圍從1976年到2015年。

通過FFPE組織的定量RT-PCR比較RNA回收率。“Q”代表競爭性商業FFPE提取試劑盒。

更高完整性RNA

對于使用RNAstorm TM試劑盒提取的RNA相對于流行的商業試劑盒，觀察到增加的DV 200值。DV 200表示使用Agilent Bioanalyzer RNA 6000納米試劑盒測量的長度大于200nt的RNA的百分比。

使用來自RNAstorm TM試劑盒和試劑盒Q所見的相同樣品的RNA獲得的BioAnalyzer痕跡的示例性疊加顯示如下。

經常問的問題

使用RNAstorm™試劑盒獲得的RNA中是否存在任何污染的基因組DNA？

基因組DNA的污染是一個很大的問題，因為它可以干擾下游應用。RNAstorm™試劑盒包括優化的DNase消化步驟，可去除污染的基因組DNA，而不會顯著影響RNA產量。雖然此步驟是可選的，但強烈建議您這樣做。

我可以從FFPE樣本中獲得多少RNA？

影響獲得的RNA總量的大變量是樣品本身的質量（即組織的類型和數量，以及分離和保存樣品時的護理）。使用RNAstorm™試劑盒，并假設至少合理的樣品質量，可以獲得大于1微克的量。

使用RNAstorm™試劑盒獲得的RNA可以用于RNA-Seq嗎？

是。只要RNA具有足夠高的質量，就可以獲得高質量的文庫。對于Illumina測序，建議使用至少30％的DV200，并且應使用提供至少1μgRNA的樣品。

如何準備組織？

使用切片機從FFPE樣品中獲得5-10μm切片。如果可以可靠地切割，則可以使用厚度小于5μm的部分。建議不要使用厚度超過10微米的部分，因為它們可能無法*消化。此外，每次提取應使用不超過5個部分（每個10μM）。使用過多的組織會導致消化不*并降低產量。

我可以使用非石蠟包埋的組織嗎？

是的，可以使用未包埋在石蠟中的組織。在這種情況下，我們建議機械研磨相當于推薦部分數量的組織。

我可以使用FFPE核心嗎？

是的，可以使用FFPE核心。由于核心不使用切片機進行處理，因此如果觀察到不*消化，則推薦樣品消化更加困難并且建議進行機械均質化（例如使用鋼珠）。

你推薦哪種脫蠟方法？

RNAstorm™試劑盒包括推薦的Deparaffinization Reagent。與其他常用方法（例如二甲苯）不同，脫石蠟試劑是，無毒的，不需要使用通風櫥。在我們的測試中，所包含的試劑在去除石蠟和允許純化高質量核酸方面至少與二甲苯一樣有效。

定量從FFPE樣品中獲得的RNA的適合方法是什么？

源自FFPE的RNA比從新鮮樣品獲得的RNA更準確地定量。僅知道RNA的量是否足夠，以及RNA是否適用于下游應用，這取決于以下因素：

• 片段大小分布：如果RNA-Seq由<200nt的片段組成，則5μg樣品（通過Qubit測量）對RNA-Seq無用。
• 化學修飾：對于從福爾馬林固定的樣品中獲得的RNA，各種化學加合物和交聯（包括堿基修飾，堿基交聯和堿 - 蛋白質交聯）可使核酸分子不能被酶接近，因此在下游應用中無活性。
• 污染：純化過程中使用的細胞碎片，蛋白質，鹽和清潔劑可能會影響下游檢測。例如，基于UV / Vis的方法如Nanodrop特別容易受到在200-280nm范圍內吸收的污染物的影響。
• 基于熒光的方法如Qubit容易出現明顯錯誤。使用低濃度的DNA或RNA時，基于染料的檢測可能不是線性的。還必須注意RNA樣品中基因組DNA的污染，因為用于熒光定量的染料并不*特異于FFPE衍生的DNA或RNA。
• 定量PCR是定量嚴重受損和修飾的核酸的優選方法。

RIN編號是否應用于確定FFPE衍生RNA的質量？

雖然RIN數可以提供有關樣品碎片程度的一般信息，但它不是敏感或可預測的，不足以成為下游性能的有用指標，特別是對于RNA-Seq。通常，FFPE衍生的RNA的RIN數字將在2到3之間。這些樣本中的一些將用于RNA-Seq，而其他樣本則不會--RIN不會告訴您。

使用Illumina測序在RNA-Seq中稍微更好的預測性是DV200，其代表長于200個核苷酸的RNA片段的百分比。DV200也是基于Bioanalyzer數據計算的，但是存在與所有基于生物分析儀的方法相同的缺點，特別是高變異性。

從FFPE樣品中提取RNA時我需要知道什么？

• 避免使用基于有機溶劑的方法（Trizol）
• 避免使用刺激的離液鹽（即胍鹽）
• 避免使用UV和/或Qubit影響下游定量的洗滌劑（例如Triton X-100）
• 不要依賴RIN來定量FFPE衍生樣品的完整性。看看為什么。請改用DV200。
• 使用從福爾馬林中去除化學修飾的試劑盒或方法。不要將溫度升至80?C或更高。即使在此溫度下短時間也會顯著降低完整性。
• 警惕Qubit和Nanodrop濃度，因為有可能被有機分子或DNA污染。
• 使用qPCR定量RNA，并始終仔細查看解鏈曲線，以確定是否可能發生非特異性擴增。