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（磁珠法）
產(chǎn)品內(nèi)容
產(chǎn)品號(hào)：K5011610（100ml 血清/血漿樣本提取試劑盒）
組分 | 產(chǎn)品號(hào) | 規(guī)格 |
1. 裂解/結(jié)合液 Lysis/Binding Buffer | K5011610-1 | 1 x 115 ml |
2. 洗滌液 Wash Buffer | K5011610-2 | 2 x 55 ml |
3. 洗脫液 Elution Buffer | K5011610-3 | 1 x 6 ml |
4. 磁珠溶液 Magnetic Bead Solution | K5011610-4 | 2 x 1.33 ml |
產(chǎn)品號(hào)：K5011625（250ml 血清/血漿樣本提取試劑盒）
組分 | 產(chǎn)品號(hào) | 規(guī)格 |
1. 裂解/結(jié)合液 Lysis/Binding Buffer | K5011625-1 | 3 x 95 ml |
2. 洗滌液 Wash Buffer | K5011625-2 | 5 x 55 ml |
3. 洗脫液 Elution Buffer | K5011625-3 | 1 x 15 ml |
4. 磁珠溶液 Magnetic Bead Solution | K5011625-4 | 5 x 1.33 ml |
該試劑盒置于室溫（15-25℃）干燥條件下，可保存 12 個(gè)月。
l 無(wú)毒。
l 高回收率。
l 操作靈活的實(shí)驗(yàn)程序。
l 純化的 DNA 可用于二代測(cè)序(NGS), 熒光定量 PCR 和亞硫酸氫鹽測(cè)序等。
本試劑盒可率從血清/血漿中提取游離 DNA，磁珠法程序適用于多種核酸自動(dòng)化提取 儀，所得游離 DNA 可直接用于 PCR 模 板、qPCR、二代測(cè)序（NGS）和其他應(yīng)用程序。 規(guī)格
100ml 血清/血漿樣本提取試劑盒
250ml 血清/血漿樣本提取試劑盒 質(zhì)量控制 所有試劑均經(jīng)過(guò)純度和有效性測(cè)試。
樣本：新鮮和凍存血清/血漿均可使用，新鮮樣本會(huì)有較高的得率。
量化：每毫升血清/血漿游離 DNA 得率為 1-100 微克。用分光光度法定量（例如. Nanodrop）
可能無(wú)法準(zhǔn)確地測(cè)定得率?？墒褂?Qubit™ dsDNA High Sensitivity Assay。
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的建議：由于血清/血漿中提取 DNA 多數(shù)為小片段特性，設(shè)計(jì)引物時(shí)需謹(jǐn)
慎。游離 DNA 往往為小片段 170bp 左右，因此，PCR 引物設(shè)計(jì)應(yīng)該生成的產(chǎn)物為小于 150 bp
范圍。健康人血漿游離 DNA 濃度低，PCR 的循環(huán)次數(shù)在某些情況下需達(dá)到 40 個(gè)循環(huán)。
treck Cell-Free DNA BCT Tube(s) 基因檢測(cè)無(wú)創(chuàng)采血管: 無(wú)創(chuàng)管經(jīng)蛋白酶 K 處理可分離高質(zhì)
量的無(wú)細(xì)胞 DNA，否則 DNA 得率會(huì)減少 50%。
l 移液管
l 渦流混合器
l 磁力架
l 1.5 ml 不黏離心管
l 無(wú)水乙醇
使用前：裂解/結(jié)合液 Lysis/Binding Buffer 及 Wash Buffer 洗滌液為濃縮液。若溶液發(fā)生 沉淀，放置 37°C 水浴中預(yù)熱 30 分鐘，以溶解沉淀。*次使用試劑盒時(shí)，請(qǐng)按照提示在裂 解/結(jié)合液 Lysis/Binding Buffer 及洗滌液 Wash Buffer 加入無(wú)水乙醇，儲(chǔ)存 2-8°C 有效期一年， 蓋緊瓶蓋以確保長(zhǎng)期存儲(chǔ)。
l 加入 23ml 無(wú)水乙醇至裂解/結(jié)合液 Lysis/Binding Buffer 中，輕輕顛倒混勻。
l 加入 51 ml 無(wú)水乙醇至每個(gè)洗滌液 Wash Buffer 中，輕輕顛倒混勻。
l 每次提取前配制新鮮 80%乙醇。
l 加入 19ml 無(wú)水乙醇至每個(gè)裂解/結(jié)合液 Lysis/Binding Buffer 中，輕輕顛倒混勻。
l 加入 51 ml 無(wú)水乙醇至每個(gè)洗滌液 Wash Buffer 中，輕輕顛倒混勻。
l 每次提取前配制新鮮 80%乙醇。
實(shí)驗(yàn)前確定要提取的血清/血漿量（100µl~10ml 均可），按下表計(jì)算所需裂解/結(jié)合液
Lysis/Binding Buffer 和 Magnetic Bead Solution 磁珠溶液使用量。
血清/血漿 | 裂解/結(jié)合液
Lysis/Binding Buffer | 磁珠溶液 Magnetic
Bead Solution | 離心管尺寸 |
x (x=ml of 血清/血漿) | 1.25x | 0.025x | N/A |
500 µl | 750 µl | 12.5 µl | 2 ml |
1 ml | 1.25 ml | 25 µl | 15 ml |
5 ml | 6.25 ml | 125 µl | 15 ml or 或 50ml* |
10 ml | 12.50 ml | 250 µl | 50 ml |
*5ml 或以上血清/血漿建議使用 50ml 離心管，使用 15ml 離心管造成泄露會(huì)造成得率降低。
如果樣品使用基因檢測(cè)無(wú)創(chuàng)采血管 Streck Cell-Free DNA BCT Tube(s)采集，蛋白酶 K 處理可
確保高回收率。非該采血管采集的樣本可直接進(jìn)行裂解/結(jié)合 Lysis/Binding 步驟。
血清/血漿 | 蛋白酶 K | 20% SDS 溶液 |
x (x=ml of 血清/血漿) | 0.015 x | 0.050 x |
500 µl | 7.5 µl | 25 µl |
1 ml | 15 µl | 50 µl |
5 ml | 75 µl | 250 µl |
10 ml | 150 µl | 500 µl |
1. 加入適量血清/血漿到適合的離心管中。
2. 每 1ml 血清/血漿加入 15 µl 蛋白酶 K（20 mg/ml）。
3. 每 1ml 血清/血漿加入 50 µl SDS（20%）溶液。
4. 顛倒混勻 5 次。
5. 60°C 孵育 20 分鐘。
6. 冰上預(yù)冷 5 分鐘，放置室溫。
7. 放置室溫后可進(jìn)行裂解/結(jié)合 Lysis/Binding 第二步
1. 加入適量血清/血漿到適合離心管中。
2. 每 1ml 血清/血漿加入 1.25ml 裂解/結(jié)合液 Lysis/Binding Buffer。
3. 每 1ml 血清/血漿加入 25µl 磁珠溶液 Magnetic Bead Solution。 注意：加入之前混勻磁珠溶液，確保溶液無(wú)磁珠沉淀。磁珠會(huì)迅速下沉所以每次加樣前都 要混勻磁珠，以免造成 DNA 得率不一致。
4. 室溫渦流混合或用力搖動(dòng)離心管 10 分鐘。*為獲得高產(chǎn)量，確保血樣本/緩沖溶液在管內(nèi)混 合，推薦使用旋渦混合器。
5. 將離心管置于磁力架磁分離 2~5 分鐘或直至溶液清透。
6. 保持離心管置于磁力架上小心去除上清，不要觸碰磁珠。
7. 保持離心管置于磁力架上 1 分鐘，去除殘液。
8. 加入 1000µl 洗滌液 Wash Buffer 至第 7 步裂解/結(jié)合 Lysis/Binding 管中。 9. 渦流混合 10 秒或移液管吹打 6 次重懸磁珠。
10. 將重懸液移至 1.5ml 離心管置于磁力架。
11. 置于磁力架 10~30 秒。
12. 移液管抽取上清至裂解/結(jié)合 Lysis/Bindin 管。
13. 將裂解/結(jié)合 Lysis/Bindin 管中剩余磁珠全部移至 1.5ml 離心管。
14. 1.5ml 離心管置于磁力架磁分離 10~30 秒至液體清澈。
15. 用 1000µl 移液槍頭盡量去除上清。
16. 用裝有離心管的磁力架輕輕敲擊實(shí)驗(yàn)臺(tái) 5 次，用 200µl 移液槍頭去除廢液。
17. 離心管移至試管架上加入 1000µl 洗滌液 Wash Buffer。
18. 渦流混合 20 秒或移液管吹打 6 次重懸磁珠。
19. 短暫離心。*離心僅用于渦流混合之重懸磁珠，短暫離心僅為去除離心管蓋上的吸附液體。
20. 離心管置于磁力架磁分離 10~30 秒。
21. 用 1000µl 移液槍頭盡量去除上清。
22. 用裝有離心管的磁力架輕輕敲擊實(shí)驗(yàn)臺(tái) 5 次，用 200µl 移液槍頭去除廢液。
23. 離心管移至試管架上加入 1000µl 乙醇（80%）。
24. 渦流混合 20 秒或移液管吹打 6 次重懸磁珠。
25. 短暫離心。
26. 離心管置于磁力架磁分離 10~30 秒至溶液清澈。
27. 用 1000µl 移液槍頭盡量去除上清。
28. 用裝有離心管的磁力架輕輕敲擊實(shí)驗(yàn)臺(tái) 5 次，用 200µl 移液槍頭去除廢液。
29. 離心管移至試管架上加入 1000µl 乙醇（80%）。
30. 渦流混合 20 秒或移液管吹打 6 次重懸磁珠。
31. 短暫離心。
32. 離心管置于磁力架磁分離 10~20 秒。
33. 用 1000µl 移液槍頭盡量去除上清并保持管蓋打開。
34. 用裝有離心管的磁力架輕輕敲擊實(shí)驗(yàn)臺(tái) 5 次。
35. 用 200µl 移液槍頭去除廢液。
36. 保持管蓋打開 2 分鐘，磁力架輕輕敲擊實(shí)驗(yàn)臺(tái) 5 次，用 200µl 移液槍頭去除廢液。
37. 繼續(xù)干燥 1-3 分鐘。*注意不要過(guò)分干燥以免磁珠粘在管壁上。
38. 離心管移至試管架上加入適量洗脫液 Elution Buffer。注意：建議每毫升血清/血漿加入 12.5
µl 洗脫液 Elution Buffer 以確保*得率。 39. 渦流混合或用力搖動(dòng)離心管 5 分鐘。
40. 短暫離心。
41. 置于磁力架 10~30 秒。
42. 上清移至新 1.5ml 離心管。
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